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一种抑制幽门螺杆菌的益生菌

发表时间:2021-06-22 13:19作者:一种抑制幽门螺杆菌的益生菌


一种抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物,其特征在于,所述益生菌组合物中包括以下重量份的菌粉:鼠李糖乳杆菌10~30份、植物乳杆菌10~30份、罗伊氏乳杆菌10~30份和唾液乳杆菌10~30份。2 .根据权利要求1所述益生菌组合物,其特征在于,所述益生菌组合物中包括以下重量份的菌粉:鼠李糖乳杆菌15~25份、植物乳杆菌15~25份、罗伊氏乳杆菌15~25份和唾液乳杆菌15~25份。3 .根据权利要求1或2所述益生菌组合物,其特征在于,所述鼠李糖乳杆菌包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LN56,保藏编号为CGMCC No .17370;所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LN66,保藏编号为CGMCC No .17369;所述罗伊氏乳杆菌包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LN83,保藏编号为CGMCC No .17541;所述唾液乳杆菌包括唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LN12,保藏编号为CGMCCNo .17542。4 .根据权利要求3所述益生菌组合物,其特征在于,所述鼠李糖乳杆菌LN56的菌粉、植物乳杆菌LN66的菌粉、罗伊氏乳杆菌LN83的菌粉和唾液乳杆菌LN12的菌粉中活菌数量均为1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g。5 .权利要求1~4任一项所述益生菌组合物在制备抑制幽门螺杆菌生长的食品或药物或补充剂中的应用。6 .权利要求1~4任一项所述益生菌组合物在制备抑制幽门螺杆菌毒力因子基因表达的食品或药物或补充剂中的应用。7 .根据权利要求6所述应用,其特征在于,所述毒力因子包括CagA、VacA和Ure。8 .权利要求1~4任一项所述益生菌组合物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。9 .一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药物,其特征在于,所述药物以权利要求1~4任一项所述益生菌组合物为有效成分。权 利 要 求 书 1/1 页2CN 112458020 A2一种抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物及应用技术领域[0001] 本发明属于食品和药品技术领域,具体涉及一种抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物及应用。背景技术[0002] 幽门螺杆菌(Helicobecter pylori,简称Hp)可引发诸多消化道疾病,其可长期寄生于胃黏膜,容易引发慢性胃炎、胃溃疡甚至胃癌,被世界卫生组织(WHO)归为I类致癌因子。[0003] 针对清除Hp的标准克拉霉素三联疗法在1996年就被提出并广泛应用,目前推荐的含铋剂的抗生素四联疗法作为临床根除Hp的首选方案,但随着Hp对抗生素耐药性的不断提升,以及抗生素和铋剂所带来的相关副作用如腹胀、腹泻和便秘等发生率的提高,大大降低了抗生素疗法的根治效果及患者的耐受性和服药依从性。[0004] 益生菌疗法是一种新兴的治疗Hp的疗法,近年来的研究和临床实践表明乳杆菌和双歧杆菌等益生菌制剂的应用在提高Hp的根除率和减少治疗副作用等方面均具有一定的疗效。益生菌治疗Hp的功能属菌株依赖型,且不同益生菌菌株组合后对于治疗Hp的效果,菌株间既可能存在协同也可能存在拮抗作用。所以对于治疗Hp的益生菌菌株的选择及不同菌株组合物治疗Hp的协同作用效果仍有待进一步的大量研究来证实。发明内容[0005] 有鉴于此,本发明的目的在于提供一种抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物及应用,所述益生菌组合物可发挥显著的抑制和杀伤幽门螺杆菌的协同作用。[0006] 为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:[0007] 本发明提供了一种抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物,所述益生菌组合物中包括以下重量份的菌粉:鼠李糖乳杆菌10~30份、植物乳杆菌10~30份、罗伊氏乳杆菌10~30份和唾液乳杆菌10~30份。[0008] 优选的,所述益生菌组合物中包括以下重量份的菌粉:鼠李糖乳杆菌15~25份、植物乳杆菌15~25份、罗伊氏乳杆菌15~25份和唾液乳杆菌15~25份。[0009] 优选的,所述鼠李糖乳杆菌包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LN56,保藏编号为 C G M C C N o .1 7 3 7 0;所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌 (L a c t o ba c i l l u splantarum)LN66,保藏编号为CGMCC No .17369;所述罗伊氏乳杆菌包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LN83,保藏编号为CGMCC No .17541;所述唾液乳杆菌包括唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LN12,保藏编号为CGMCC No .17542。[0010] 优选的,所述鼠李糖乳杆菌LN56的菌粉、植物乳杆菌LN66的菌粉、罗伊氏乳杆菌LN83的菌粉和唾液乳杆菌LN12的菌粉中活菌数量均为1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g。[0011] 本发明还提供了上述益生菌组合物在制备抑制幽门螺杆菌生长的食品或药物或补充剂中的应用。说 明 书 1/11 页3CN 112458020 A3[0012] 本发明还提供了上述益生菌组合物在制备抑制幽门螺杆菌毒力因子基因表达的食品或药物或补充剂中的应用。[0013] 优选的,所述毒力因子包括CagA、VacA和Ure。[0014] 本发明还提供了上述益生菌组合物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。[0015] 本发明还提供了一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药物,所述药物以上述益生菌组合物为有效成分。[0016] 本发明提供了一种抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物,所述益生菌组合物对于幽门螺杆菌的抑制和杀伤作用显著高于单一菌株;且所述益生菌组合物较单一菌株更能有效降低幽门螺杆菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表达水平,因此所述益生菌组合物中的4种菌产生了显著的协同效应。[0017] 本发明实施例证明,经口服一定数量所述益生菌组合物后,可在体内有效抑制幽门螺杆菌生长,降低幽门螺杆菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表达水平,从而减少对胃黏膜细胞的空包化损伤等,抑制脲酶Ure的基因表达使幽门螺杆菌产氨能力下降,使其周围环境的pH下降不利于其自身的生长而易被抗生素杀灭。对于幽门螺杆菌感染模型小鼠,使其进食所述益生菌组合物,清除幽门螺杆菌的效果显著优于各菌株单独应用的效果,所述益生菌组合物的应用能够根除小鼠胃黏膜上的幽门螺杆菌并使炎症消失。人体服用所述益生菌组合物的结果也表明,该组合物可显著降低人体中幽门螺杆菌数量,有效率达90%,幽门螺杆菌转阴率达70%。[0018] 生物保藏信息[0019] 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LN56,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏机构简称:CGMCC,保藏日期为2019年03月20日,生物保藏编号为CGMCC No .17370;[0020] 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LN66,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏机构简称:CGMCC,保藏日期为2019年03月20日,生物保藏编号为CGMCC No .17369;[0021] 罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LN83,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏机构简称:CGMCC,保藏日期为2019年04月10日,生物保藏编号为CGMCC No .17541;[0022] 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LN12,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏机构简称:CGMCC,保藏日期为2019年04月10日,生物保藏编号为CGMCC No .17542。具体实施方式[0023] 本发明提供了一种抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物,所述益生菌组合物中包括以下重量份的菌粉:鼠李糖乳杆菌10~30份、植物乳杆菌10~30份、罗伊氏乳杆菌10~30份和唾液乳杆菌10~30份。[0024] 本发明所述益生菌组合物中,所述鼠李糖乳杆菌的重量份优选为15~25份,更优选为20份。本发明所述鼠李糖乳杆菌优选包括鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)说 明 书 2/11 页4CN 112458020 A4LN56,保藏编号为CGMCC No .17370。本发明所述鼠李糖乳杆菌LN56的菌粉中活菌数量优选为1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g,更优选为5 .0×1010~2 .0×1011CFU/g,最优选为8 .0×1010CFU/g。本发明对所述鼠李糖乳杆菌LN56的菌粉的制备方法并没有特殊限定,优选包括:1)将所述鼠李糖乳杆菌LN56接种在MRS培养液或改良MRS培养液中,在36~38℃下发酵12~24h,得到鼠李糖乳杆菌LN56发酵液;所述改良MRS培养液以MRS培养液为基础培养基,包含质量浓度为0 .05%的半胱氨酸盐酸盐;[0025] 2)将所述鼠李糖乳杆菌LN56发酵液离心,收集沉淀物,得到鼠李糖乳杆菌LN56菌泥;[0026] 3)将所述鼠李糖乳杆菌LN56菌泥进行真空冷冻干燥,得到鼠李糖乳杆菌LN56的菌粉。[0027] 本发明步骤1)所述接种的接种量优选为1,所述发酵的温度优选为37℃,所述发酵的时间优选为20h。本发明所述发酵优选为厌氧发酵。本发明步骤2)所述离心的转速优选为8000~12000r/min,更优选为10000r/min;所述离心的时间优选为60~120min,更优选为90min。本发明步骤3)中所述真空冷冻干燥,优选包括:将菌泥、水、冻干载体混合后进行真空冷冻干燥;所述菌泥、水、冻干载体的质量比优选为1:(1~6):(1~5),更优选为1:3:2。本发明所述冻干载体优选包括脱脂奶粉或麦芽糊精。本发明对所述真空冷冻干燥的仪器并没有特殊限定,优选采用东富龙LYO-20真空冷冻干燥机,在进行真空冷冻干燥时,优选设置传热隔板温度为-10~10℃,更优选为-5℃;干燥箱中真空度优选设置为10~16Pa,更优选为13Pa。本发明所述真空冷冻干燥的时间优选为20~48h,更优选为28h。本发明所述鼠李糖乳杆菌LN56能够抑制幽门螺杆菌的生长,降低幽门螺杆菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表达量。[0028] 本发明所述益生菌组合物中包括植物乳杆菌的菌粉,所述植物乳杆菌的菌粉重量份优选为15~25份,更优选为20份。本发明所述植物乳杆菌的菌粉的制备方法优选与上述相同,在此不再赘述。本发明所述植物乳杆菌优选包括植物乳杆菌 (La cto ba cillusplantarum)LN66,保藏编号为CGMCC No .17369。本发明所述植物乳杆菌LN66的菌粉中活菌数量优选为1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g,更优选为5 .0×1010~2 .0×1011CFU/g,最优选为8 .0×1010CFU/g。本发明中,所述植物乳杆菌LN66能够抑制幽门螺杆菌的生长,降低幽门螺杆菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表达量。[0029] 本发明所述益生菌组合物中优选包括罗伊氏乳杆菌15~25重量份,优选为20重量份。本发明所述罗伊氏乳杆菌的菌粉的制备方法优选与上述相同,在此不再赘述。本发明所述罗伊氏乳杆菌优选包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)LN83,保藏编号为CGMCCNo .17541。本发明所述罗伊氏乳杆菌LN83的菌粉中活菌数量为1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g,优选为1 .0×1010~1 .5×1011CFU/g,更优选为2 .0×1010~1 .0×1011CFU/g,最优选为5 .0×1010CFU/g。本发明中所述罗伊氏乳杆菌LN83能够抑制幽门螺杆菌的生长,降低幽门螺杆菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表达量。[0030] 本发明所述益生菌组合物中优选包括15~25重量份的唾液乳杆菌,更优选为20份。本发明所述唾液乳杆菌的菌粉的制备方法优选与上述相同,在此不再赘述。本发明所述唾液乳杆菌优选包括唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)LN12,保藏编号为CGMCCNo .17542。本发明所述唾液乳杆菌LN12的菌粉中活菌数量为1 .0×1010~3 .0×1011CFU/g,说 明 书 3/11 页5CN 112458020 A5优选为1 .0×1010~1 .5×1011CFU/g,更优选为2 .0×1010~1 .0×1011CFU/g,最优选为5 .0×1010CFU/g。本发明中所述唾液乳杆菌LN12能够抑制幽门螺杆菌的生长,降低幽门螺杆菌毒力因子CagA和VacA的基因表达量。[0031] 本发明优选将上述鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和唾液乳杆菌按照1:1:1:1的质量比混合后,可产生协同增效作用:如4株单一菌株LN56、LN66、LN83和LN12的抑菌圈直径分别为18 .33mm、18 .43mm、17 .33mm和17 .02mm,而益生菌组合物的抑菌圈直径为24 .48mm,具有极显著差异;4株单一菌株LN56、LN66和LN83对毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表达量略有下调作用,LN12不具有下调作用,但是益生菌组合物可使CagA、VacA和Ure的基因表达量分别下调20倍、10倍和8倍;单独应用上述四株菌,只能使幽门螺杆菌数量降低和炎症程度降低而不能使其根除和消失,但是所述益生菌组合物能够根除小鼠胃黏膜上的幽门螺杆菌并使炎症消失,因此可将所述益生菌组合物用于预防和/或治疗幽门螺杆菌感染。[0032] 本发明还提供了上述益生菌组合物在制备抑制幽门螺杆菌生长的食品或药物或补充剂中的应用。本发明对所述食品或药物或补充剂的剂型并没有特殊限定,优选为粉剂、片剂、颗粒剂、水剂、丸剂、胶囊剂或凝胶剂,更优选为粉剂。在本发明中,当所述食品或药物或补充剂的剂型为粉剂时,优选还包括辅料,所述辅料优选为麦芽糊精、赤藓糖醇和低聚果糖。本发明对所述食品或药物或补充剂的制备方法并没有特殊限制,采用本领域常规制备方法即可。本发明所述食品或药物或补充剂中益生菌组合物的质量百分含量优选为20%~100%,更优选为90%。[0033] 本发明还提供了上述益生菌组合物在制备抑制幽门螺杆菌毒力因子基因表达的食品或药物或补充剂中的应用。本发明所述毒力因子优选包括CagA、VacA和Ure,且相比于空白对照,食用所述益生菌组合物后,CagA、VacA和Ure的基因表达量分别下调20倍、10倍和8倍。本发明所述食品或药物或补充剂的剂型及制备方法优选与上述内容相同,在此不再赘述。[0034] 本发明还提供了上述益生菌组合物在制备预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药物中的应用。本发明口服一定数量的所述药物后,可在体内有效抑制幽门螺杆菌生长,降低幽门螺杆菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表达水平,从而减少对胃黏膜细胞的空包化损伤等,抑制脲酶Ure的基因表达使幽门螺杆菌产氨能力下降,使其周围环境的pH值下降不利于其自身的生长而易被抗生素杀灭;利用所述药物处理幽门螺杆菌感染模型小鼠,其清除幽门螺杆菌的效果显著优于LN56、LN66、LN83和LN12菌株单独应用的效果,4株益生菌组合物的应用能够根除小鼠胃黏膜上的幽门螺杆菌并使炎症消失,而单独应用上述四株菌,只能使幽门螺杆菌数量降低和炎症程度降低而不能使其根除和消失。人体服用所述益生菌组合物的结果也表明,所述药物可显著降低人体中幽门螺杆菌数量,有效率达90%,幽门螺杆菌转阴率达70%。[0035] 本发明还提供了一种预防和/或治疗幽门螺杆菌感染的药物,所述药物以上述益生菌组合物为有效成分。[0036] 本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定,优选为粉剂、片剂、颗粒剂、水剂、丸剂、胶囊剂或凝胶剂,更优选为粉剂。在本发明中,当所述药物的剂型为粉剂时,优选还包括辅料,所述辅料优选为麦芽糊精、赤藓糖醇和低聚果糖。本发明对所述药物的制备方法并没说 明 书 4/11 页6CN 112458020 A6有特殊限制,采用本领域常规制备方法即可。本发明所述药物中益生菌组合物的质量百分含量优选为20%~100%,更优选为90%。本发明在利用所述药物预防和/或治疗幽门螺杆菌感染时,以所述益生菌组合物的用量计,优选服用量为1~20g/天,更优选为8g/天。[0037] 下面结合实施例对本发明提供的一种抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物及应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0038] 实施例1[0039] 采用鼠李糖乳杆菌LN56、植物乳杆菌LN66、罗伊氏乳杆菌LN83和唾液乳杆菌LN12;分别在MSR培养基中37℃下兼性厌氧活化培养24h后以10000rpm转速离心10min去除菌体得到无细胞发酵上清液,分别检测单种菌的无细胞发酵上清液(CFS)及这4种菌的CFS的组合物对幽门螺杆菌的抑制效果。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori ATCC 43504)购于美国菌种保藏中心。幽门螺杆菌固体培养采用含10%无菌脱纤维羊血哥伦比亚血琼脂培养基在37℃微需氧条件下培养3~4d,液体培养采用含10%胎牛血清布氏肉汤培养基在37℃微需氧条件下,80rpm培养2~3d。[0040] 具体检测方法为:牛津杯扩散实验法,将对数中期的幽门螺杆菌菌液用肉汤培养液将细菌密度调节至2×106CFU/mL,取200μL菌液至含10%无菌脱纤维羊血哥伦比亚血琼脂培养基平板并用无菌玻耙涂布均匀,用镊子将牛津杯小心放置在该固体平板上,分别取上述制备的鼠李糖乳杆菌LN56的CFS、植物乳杆菌LN66的CFS液、罗伊氏乳杆菌LN83的CFS、唾液乳杆菌LN12的CFS和上述4种菌的CFS等比例组合物各200μL注入牛津杯孔径内,以MRS液体培养基作为阴性对照。先将固体平板在4℃冰箱扩散3~4h,然后将平板转移至37℃培养箱微好氧培养,48h后观察抑菌结果并用游标卡尺测量抑菌圈的直径,重复3次。[0041] 单一益生菌的CFS和4种CFS的等比例组合物对幽门螺杆菌的抑菌效果如表1所示,单一益生菌CFS对幽门螺杆菌均具有不同程度的抑制作用,而4种益生菌的CFS等比例组合物对幽门螺杆菌的抑制效果明显大于单一益生菌CFS的抑制效果,具有显著的协同效应。[0042] 表1益生菌CFS对幽门螺杆菌的抑制作用[0043][0044] 注:*表示与MRS比存在显著性差异(P<0 .05),**表示4种菌等比例组合物与单种菌比存在显著性差异(P<0 .05)[0045] 实施例2[0046] 采用实施例1所获得的鼠李糖乳杆菌LN56、植物乳杆菌LN66、罗伊氏乳杆菌LN83、说 明 书 5/11 页7CN 112458020 A7唾液乳杆菌LN12的无细胞发酵上清液(CFS)及这4种菌的CFS的组合物,检测对幽门螺杆菌毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表达水平的影响。[0047] 具体检测方法为:将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori ATCC 43504)在10%胎牛血清布氏肉汤培养基中微好氧培养48~72h,用肉汤稀释菌液至细菌密度为1×107CFU/mL。在不同三角瓶中分别加入5mL LN56 CFS、5mL LN66 CFS、5mL LN83 CFS、5mL LN12 CFS、及5mL以上4种菌CFS的等比例组合物(各1 .25mL),然后在每个三角瓶中再分别加入5mL 10%胎牛血清布氏肉汤培养基和10mL 1×107CFU/mL的Hp菌液,37℃微好氧培养48~72h,80rpm。对照组用5mL MRS替换CFS。[0048] 完成培养后,对每个三角瓶中的内容物离心弃去上清液,用无菌PBS缓冲液小心地清洗菌体、离心,随后加入10mL无菌PBS缓冲液,反复吹打,转移至无RNA酶污染的离心管中。总RNA的提取采用TransZol Up Plus RNA Kit进行。在得到总RNA后,通过PrimeScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser反转录合成cDNA。最后加入TB Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)染料在qTOWER3G荧光定量PCR仪上进行荧光定量检测。实验中所用引物列于表2。荧光定量PCR仪参数设置为:95℃预变性2min;循环40次:95℃,15s;55℃,15s;68℃,20s。最后,以Hp 16S rRNA为内参基因,通过2-ΔΔCt法处理实验数据,确定基因相对表达量,结果见表3,4种CFS等比例组合物对Hp分泌的主要毒力因子基因表达水平的抑制作用显著强于单个菌的CFS的抑制作用,说明所述4个菌的CFS组合物对所述毒力因子的基因表达的抑制具有协同效应,差别具有统计学意义(P<0 .05)。与对照组相比,所述4个菌的CFS组合物使CagA、VacA和Ure的基因表达量分别下调了约20倍、10倍和8倍,而单个菌的CFS对CagA的基因表达量的下调幅度为2 .31倍~4 .76倍,对VacA的基因表达量的下调幅度为2 .20倍~2 .82倍,对Ure的基因表达量的下调幅度为1倍~3 .31倍,其中LN12 CFS对Ure的基因表达量没有下调作用。可以看出,LN56、LN66、LN83和LN12单个菌的CFS对Hp的3个毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表达量虽有下调作用,但总体上均显著小于所述4个菌的CFS组合物对他们的下调作用。4个菌的CFS等比例组合物比单个菌的CFS能更显著地抑制Hp毒力因子CagA、VacA和Ure的基因表达水平,说明所述4个菌的CFS组合物能更好地削弱Hp的毒性。[0049] 表2实时荧光定量PCR引物[0050][0051][0052] 表3益生菌CFS对Hp毒力因子基因表达水平的抑制作用说 明 书 6/11 页8CN 112458020 A8[0053][0054] 注:表中数值为mRNA相对表达量,*表示4种CFS组合物与单CFS存在显著性差异(P<0 .05)[0055] 实施例3[0056] 将鼠李糖乳杆菌LN56、植物乳杆菌LN66、罗伊氏乳杆菌LN83和唾液乳杆菌LN12分别接种在MRS培养液中在37℃下发酵16~24h,分别得到鼠李糖乳杆菌LN56发酵液、植物乳杆菌LN66发酵液、罗伊氏乳杆菌LN83发酵液和唾液乳杆菌LN12发酵液;[0057] 将鼠李糖乳杆菌LN56发酵液、植物乳杆菌LN66发酵液、罗伊氏乳杆菌LN83发酵液和唾液乳杆菌LN12发酵液分别以10000r/min离心90min,收集沉淀物,分别得到鼠李糖乳杆菌LN56菌泥、植物乳杆菌LN66菌泥、罗伊氏乳杆菌LN83菌泥和唾液乳杆菌LN12菌泥;[0058] 将得到的鼠李糖乳杆菌LN56菌泥、植物乳杆菌LN66菌泥、罗伊氏乳杆菌LN83菌泥或唾液乳杆菌LN12菌泥分别与菌泥3倍重量份的水和菌泥2倍重量份的冻干载体混合,在-5℃下进行真空冷冻干燥28h,分别得到鼠李糖乳杆菌LN56的菌粉、植物乳杆菌LN66的菌粉、罗伊氏乳杆菌LN83的菌粉或唾液乳杆菌LN12的菌粉。[0059] 实施例4[0060] 取10g实施例3制备得到的鼠李糖乳杆菌LN56的菌粉(活菌数为1 .0×1011CFU/g)、30g实施例3制备得到的植物乳杆菌LN66的菌粉(活菌数为1 .0×1011CFU/g)、10g实施例3制备得到的罗伊氏乳杆菌LN83的菌粉(活菌数为3 .0×1010CFU/g)、30g实施例3制备得到的唾液乳杆菌LN12的菌粉(活菌数为3 .0×1010CFU/g)和60g麦芽糊精以1000r/min的转速搅拌10min,得到抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物。[0061] 实施例5[0062] 取30g实施例3制备得到的鼠李糖乳杆菌LN56的菌粉(活菌数为3 .0×1010CFU/g)、10g实施例3制备得到的植物乳杆菌LN66的菌粉(活菌数为3 .0×1010CFU/g)、30g实施例3制备得到的罗伊氏乳杆菌LN83的菌粉(活菌数为1 .0×1011CFU/g)、10g实施例32制备得到的唾液乳杆菌LN12的菌粉(活菌数为1 .0×1011CFU/g)和60g麦芽糊精以1000r/min的转速搅拌10min,得到抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物。[0063] 实施例6[0064] 取20g实施例3制备得到的鼠李糖乳杆菌LN56的菌粉(活菌数为8 .0×1010CFU/g)、20g实施例3制备得到的植物乳杆菌LN66的菌粉(活菌数为8 .0×1010CFU/g)、20g实施例3制备得到的罗伊氏乳杆菌LN83的菌粉(活菌数为5 .0×1010CFU/g)、20g实施例3制备得到的唾说 明 书 7/11 页9CN 112458020 A9液乳杆菌LN12的菌粉(活菌数为5 .0×1010CFU/g)和60g麦芽糊精以1000r/min的转速搅拌10min,得到抑制幽门螺杆菌的益生菌组合物。[0065] 实施例7[0066] 选取8~10周龄健康雄性SPF级BABL/C小鼠188只,除阴性对照组20只外,其余小鼠予幽门螺杆菌(Hp)(含量109cfu/ml)新鲜悬菌液1ml灌胃,隔天1次,共8次。末次灌胃1周后,取8只小鼠杀死后取胃黏膜进行快速尿素酶试验,结果均为阳性,胃黏膜组织HE染色镜检显示胃黏膜上皮细胞脱落并有炎性细胞浸润,胃黏膜组织特殊银染色镜检显示Hp,两者皆证实Hp感染模型已建立。[0067] 已确立Hp感染的小鼠,按随机表格法随机分为以下8组(每组20只),再加上阴性对照组20只,阴性对照组和Hp感染阳性对照组灌胃PBS缓冲液,其余7组分别灌胃实施例4、5和6制备得到的益生菌组合物(4 .0×109CFU/天),以及实施例3制备的鼠李糖乳杆菌LN56(4 .0×109CFU/天)、植物乳杆菌LN66(4 .0×109CFU/天)、罗伊氏乳杆菌LN83(4 .0×109CFU/天)和唾液乳杆菌LN12(4 .0×109CFU/天)。每天1次,连续灌胃处理14d,最后一次灌胃后1周将小鼠全部处死,取胃黏膜行组织病理学特殊银染色评估Hp分布情况,HE染色镜检观察胃黏膜炎症程度评分。具体结果如表4所示,4株益生菌的组合物可显著抑制幽门螺杆菌感染模型小鼠的幽门螺杆菌,特别是实施例6能够使95%的小鼠胃黏膜的幽门螺杆菌转阴、炎症消失;而单独应用上述4株菌,只能使幽门螺杆菌数量降低和炎症程度降低而不能使其转阴和消失。因此4株益生菌组合物的联合应用,其抑制幽门螺杆菌效果显著优于LN56、LN66、LN83和LN12菌株的单独应用,且这4株益生菌的组合物具有协同效应,相比单独任一菌株能更有效地抑制幽门螺杆菌。[0068] 表4益生菌对幽门螺杆菌感染模型小鼠的作用效果说 明 书 8/11 页10CN 112458020 A10[0069][0070][0071] 注:表中数据为小鼠数量,-,+,++,+++分别代表幽门螺杆菌/炎症程度的阴性/无炎症、轻度阳性/轻度炎症、中度阳性/中度炎症和重度阳性/重度炎症。灌胃后生长过程中的小鼠有死亡,所以在不同的分组中小鼠数量有少于20只的情况。分组后阳性对照组和阴性对照组在首次灌胃前分别处死10只小鼠,测定Hp分布和炎症程度评分。[0072] 实施例8[0073] 分别应用本发明制备得到的益生菌组合物(4株菌活菌含量分别为2 .0×1010CFU/天,总活菌含量8 .0×1010CFU/天)和低剂量的该4株菌组合物(4株菌活菌含量分别为2 .0×109CFU/天,总活菌含量8 .0×109CFU/天)让20名幽门螺杆菌阳性患者服用。采用13C-尿素呼气试验检测幽门螺杆菌的变化:患者先憋气15s,吐出一半的气体,再将另外部分的气体吹说 明 书 9/11 页11CN 112458020 A11入集气袋,称为零气;矿泉水送服13G胶囊1粒,静坐30min后采集呼出的气体,此为样气,将0min和30min的样气用红外光谱仪进行检测,记录检测结果,具体结果如表5所示,幽门螺杆菌感染患者服用本发明益生菌组合物14天后,其感染程度开始有下降趋势,服用28天后,90%患者有明显疗效,其中70%患者幽门螺杆菌转阴。同时以低于本发明规定剂量的益生菌组合物为对照,结果发现,患者服用28天后,抑制幽门螺杆菌的效果显著低于本发明所述益生菌组合物,没有患者能够幽门螺杆菌转阴。结果表明,本发明所述益生菌组合物中活菌含量为每种菌不低于2 .0×1010CFU/天,总活菌数不低于8 .0×1010CFU/天。[0074] DOB值判定:30min样气中所测13C-CO2的δ减去零时δ呼气样品的δ值之差:DOB=δ(30min)-δ(0min),DOB-4 .0%~4 .0%为阴性(-),DOB 4%~10%为轻度阳性(+),DOB 10%~20%为中等阳性(++),DOB>20%为强阳性(+++)。[0075] 表5不同活菌含量治疗幽门螺杆菌感染的治疗效果[0076][0077] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应说 明 书 10/11 页12CN 112458020 A12视为本发明的保护范围。
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